Op 16 maart 1586 trad Oldenbarnevelt in functie als advocaat van den lande (zie landsadvocaat) van Holland en West-Friesland. Als pensionaris van Rotterdam had hij al een vooraanstaande plaats in de Staten van Holland. Namens dit college nam hij deel aan de voorbereidingen van de Unie van Utrecht, waarin het hem maar gedeeltelijk gelukte het beginsel van de religievrede te waarborgen, dat hem als tolerant humanist zeer ter harte ging.

Oldenbarnevelt slaagde er als landsadvocaat in het gezag van de regentenfamilies te laten zegevieren over de centralisatiepolitiek van Leicester, die namens de Engelse koningin Elizabeth I landvoogd was van de Nederlandse provinciën.